CRISPR/Cas9?衍生技術

隨著?CRISPR/Cas?系統的研究不斷深入，Cas9?核酸酶的催化機制也被揭示，并且可以通過特定位點氨基酸的突變獲得單鏈靶向剪切功能的?Cas9?切刻酶（Cas9 nickase，Cas9n）或者全失活的?Cas9（dead Cas9，dCas9），而這些不同的?Cas9?核酸酶，衍生出了適用范圍更為廣泛的基因編輯系統。

CRISPR/Cas9-nickase?基因編輯技術。CRISPR/Cas9?系統使用的?crRNA?能容受一定程度的錯配導致脫靶效應的產生，限制了?CRISPR/Cas9?系統在高精度編輯中的應用。為了提高?Cas9?編輯系統的精度，Ran?等巧妙利用?Cas9 D10A?突變體具備切刻酶活性的特性，設計了“一個位點，雙?sgRNA?靶向”的策略，即?CRISPR/Cas9-nickase?基因編輯技術（圖?2a）。其原理與?ZFN?和?TALEN?類似，兩個?Cas9n/sgRNA?復合物同時靶向一個位點，分別切割其中一條?DNA?鏈，實現雙鏈斷裂，誘導?NHEJ?或者?HR?修復。使用這種策略，細胞系中基因編輯的脫靶效率最高可以降低近?4?個數量級。

CRISPR/dCas9-FoKI基因編輯技術。同樣是為了解決?CRISPR/Cas9?技術的脫靶問題，Guilinger?等采用了基于?dCas9?的策略。理論上?dCas9/sgRNA?只能起到單純的靶向引導作用，無法誘導?DNA?的斷裂，類似于?ZFN?或者?TALEN?中的?DNA?結合結構域。為了實現?DNA?的切割，其引入的?FoKI?核酸內切酶的切割結構域（圖?2b），與?dCas9?連接做成融合蛋白?fCas9，這與?ZFN?及?TALEN?的設計策略如出一轍。在人類細胞的基因編輯中，fCas9?的特異性比野生型?Cas9?要高出?140?倍以上。而在高度類似的脫靶位點上，fCas9?的特異性要比?Cas9n?至少高出?4?倍。fCas9?的應用將進一步豐富?Cas9?工具箱，提供更完善的基因編輯工具。

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